【用途】 用于小鵝瘟病毒核酸的檢測。
【試劑】
編號 |
20T |
50T |
保存 |
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裂解液 |
4mL |
10mL |
室溫 |
A盒 |
無水乙醇 |
4mL |
10mL |
室溫 |
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去蛋白漂洗液 |
12mL |
28mL |
室溫 |
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洗滌液 |
32mL |
77mL |
室溫 |
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洗脫液 |
2mL |
5mL |
室溫 |
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蛋白酶K |
0.2mL |
0.5mL |
-20℃ |
B盒 |
PCR反應液 |
200μL |
500μL |
-20℃ |
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引物 |
40μL |
100μL |
-20℃ |
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陽性對照 |
30μL |
30μL |
-20℃ |
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陰性對照 |
300μL |
300μL |
-20℃ |
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DL2000 DNA Marker |
20μL |
50μL |
-20℃ |
【操作步驟】
1.樣本前處理及核酸提取
樣本前處理:
取適量病料心、肝、腸等組織,于滅菌研缽充分研磨,用PBS按照1:3體積稀釋成均勻乳劑,經10 000rpm離心3 min。
核酸提取:
(1)取200μL上述樣本離心后上清液和10μL蛋白酶K加入一只新的1.5mL離心管,然后加入200μL裂解液,劇烈振蕩。(蛋白酶K開蓋使用后建議存于2-8℃)混勻5~10秒。
(2)56℃溫浴10分鐘。
(3)在上述離心管中加入200μL無水乙醇,充分振蕩混勻5~10秒。
(4)將步驟3中混勻的液體轉移至一只套有收集管的純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,棄去套管內液體。
(5)將500μL去蛋白漂洗液加入純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,并棄去套管內液體。
(6)將700μL洗滌液加入純化柱上,10 000rpm離心1分鐘,并棄去套管內液體。
(7)可選:重復步驟(6)。
(8)再將純化柱放回接液管上,13 000rpm離心1分鐘。
(9)將純化柱移到一只干凈的1.5mL離心管中。
(10)向離心柱內加50μL洗脫液,室溫靜置1分鐘后12 000rpm離心1分鐘,棄純化柱,離心管內液體中含有基因組DNA。提純的基因組DNA如果不立即使用,請保存于-20℃。
2. PCR加樣體系(總體系20 μL):將下列試劑加入PCR反應管中。