產品介紹
非洲豬瘟單抗制備實驗進程
1、免疫時間計劃表
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實驗進程 |
日期 |
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初免 |
2021.03.26 |
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二免 |
2021.04.02 |
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三免 |
2021.04.09 |
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四免 |
2021.04.16 |
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融合 |
2021.04.19 |
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篩選 |
2021.04.26 |
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亞一篩選 |
2021.05.02 |
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亞二篩選 |
2021.05.08 |
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亞三篩選 |
2021.05.14 |
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腹水 |
2021.05.23 |
2、二免效價、抗體特異性
加入免疫抗體100μL /孔， 輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應20min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。再加入酶標物100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應20min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
結果及結論見下表：
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Ag 500倍 |
Ag 1k倍 |
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1-Ab 500倍 |
4.71 |
4.28 |
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1-Ab 5k倍 |
3.58 |
3.12 |
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2-Ab 500倍 |
4.52 |
3.97 |
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2-Ab 5k倍 |
2.45 |
2.01 |
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結論 |
1、Ag包被濃度為3K倍。 |
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2、二免效價較高。 |
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3、篩選效價
3.1 篩選效價
加入酶標物50μL /孔， 再加入細胞上清50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。結果見下圖：
結論：共選62個陽性孔的細胞進行抗體特異性測定。
3.2 篩選抗體特異性
加入酶標物50μL /孔， 再加入細胞上清50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。結果見下圖：
結論：共選出14株效價高、抗體特異性好的細胞進行第一次亞克隆。
株號有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2
5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
4、亞一篩選效價
加入酶標物50μL /孔， 再加入細胞上清50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
結論：共選出10株效價高的細胞進行第二次亞克隆。
株號有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
5、亞二篩選效價
加入酶標物50μL /孔， 再加入細胞上清50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
結論：經顯微鏡觀察，有四株細胞100%純陽性（5D2 5D4 5D7 3F10）擴大并凍存； 有六株細胞細胞進行第三次亞克隆。
三次亞克隆株號有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
6、亞三篩選效價
加入酶標物50μL /孔， 再加入細胞上清50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
結論：經顯微鏡觀察，有四株細胞100%純陽性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）擴大并凍存；
4F10和3D6株細胞轉陰性，扔之。
7.腹水效價
將篩選到的非洲豬瘟8株單抗，制備腹水并測腹水效價。
加入酶標物50μL /孔， 再加入稀釋后的抗體50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應30min。小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，加入洗滌工作液250μL/孔，每次靜置20s，甩去孔內液體，重復洗滌3次，最后一次用吸水紙拍干。加入底物液A液50μL/孔，再加底物顯色液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37℃避光環境中反應10min。
結果及結論見下表：
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細胞株 |
Ab-5w |
Ab-10W |
效價 |
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2C4 |
3.98 |
3.17 |
>10w |
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3F10 |
3.29 |
1.63 |
>10w |
|
4F4 |
3.54 |
1.55 |
>10w |
|
5D2 |
4.37 |
2.11 |
>10w |
|
5D4 |
3.54 |
1.62 |
>10w |
|
5D7 |
3.96 |
1.91 |
>10w |
|
7D4 |
4.19 |
2.54 |
>10w |
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8G10 |
1.36 |
0.84 |
10w |
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結論 |
非洲豬瘟篩選到8株單克隆抗體，腹水效價10w以上。 |
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非洲豬瘟單抗配對初步測試
ASFV共8株Ab，各按生產條件標記1條金墊后測試結果
標記：1號.2C4 2號.3F10 3號.4F4 4號.5D2 5號.5D4 6號.7D4 7號.8G10 8號.混合 9號.兔多抗
劃線：用9株Ab同時劃9種T線，1/1稀釋.稀釋液是動物CB液
（一） 金墊標記：1-8號單抗；T線：兔多抗劃線1:1（動物包被液稀釋）；
最初先用 1-8號金條和兔多抗1：1 劃線測試陽性病料（1:5，用2*樣稀稀釋，非處理樣品墊），如圖1，8-10分觀察，結論：爬速過快，需要調整爬速。
結論如下表：
1-8號金條與兔多抗1：1 測試陽性結果
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1號金墊 |
2號金墊 |
3號金墊 |
4號金墊 |
5號金墊 |
6號金墊 |
7號金墊 |
8號金墊 |
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劃線兔多抗1：1 |
+ |
+ |
+- |
+ |
++ |
- |
- |
+ |
繼續優化實驗方案，用 1-8號金條和兔多抗1：1 分別測試陽性病料（1:5，用1*樣稀稀釋，用濾血膜）和豬陰性血清（1:5，用1*樣稀稀釋），8-10分觀察，分別如圖3和圖4
（二） 顛倒測試，金墊標記：9號兔多抗標記；T線：1，2，3,4,5,8號單抗1：1（動物包被液稀釋）；
陽性見圖6，陰性見圖7。 結論1,2號抗體最好。
9號兔多抗標記金條與1，2，3,4,5,8號抗體劃線測試陰陽性結果
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1號Ab劃線 |
2號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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兔多抗標記的金墊 |
陽性 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
陰性 |
+--- |
+--- |
+-- |
+- |
+- |
+- |
（三） 對摸索到的六株單抗進行交叉配對測試（1號.2C4 2號.3F10 3號.4F4 4號.5D2 5號.5D4 8號.混合）
（1）1號抗體標記金條，依次為2 3 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖8.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖9
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2號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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1號抗體標記的金墊 |
陽性 |
+- |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
陰性 |
+-- |
+- |
+-- |
+-- |
+-- |
（2）2號抗體標記金條，依次為1 3 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖10.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖11
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1號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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2號抗體標記的金墊 |
陽性 |
+ |
++ |
+ |
+ |
++ |
|
陰性 |
+-- |
+- |
+-- |
+-- |
+- |
（3）3號抗體標記金條，依次為1 2 4 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖12.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖13
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1號Ab劃線 |
2號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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3號抗體標記的金墊 |
陽性 |
+ |
+ |
++ |
+ |
++ |
|
陰性 |
+-- |
+-- |
+-- |
+-- |
+- |
（4）4號抗體標記金條，依次為1 2 3 5 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖14.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖15
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1號Ab劃線 |
2號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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4號抗體標記的金墊 |
陽性 |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
|
陰性 |
+- |
+-- |
+- |
+- |
+- |
（5）5號抗體標記金條，依次為1 2 3 4 8號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖16.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖17
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1號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
8號Ab劃線 |
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2號抗體標記的金墊 |
陽性 |
+- |
++ |
+ |
+ |
++ |
|
陰性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
（6）8號抗體標記金條，依次為1 2 3 4 5號抗體1：1劃線，測試陽性（病料1:5稀釋，用1*樣稀），見圖18.測試陰性（豬血清1:5，用1*樣稀），結果見圖19
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1號Ab劃線 |
2號Ab劃線 |
3號Ab劃線 |
4號Ab劃線 |
5號Ab劃線 |
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8號抗體標記的金墊 |
陽性 |
++ |
+ |
++ |
+ |
+ |
|
陰性 |
+-- |
+-- |
+- |
+-- |
+- |
結論：經重復觀察實驗，以下四組單抗交叉配對效果較好。
2號抗體（3F10）標記配對3號抗體（4F4 ）劃線
2號抗體（3F10）標記配對8號抗體（8株混合后）劃線
3號抗體（4F4 ）標記配對4號抗體（5D2）劃線
3號抗體（4F4 ）標記配對8號抗體（8株混合后）劃線